概述
Kinetix22 与 THUNDER Imager Cell 活细胞成像
引言
对大型结构复杂生物样本的活细胞成像对显微镜实验条件提出相互竞争的要求。此类研究通常需要大视场、亚细胞分辨率、高灵敏度和快速采集，同时保持低照明剂量以实现长时间可靠定量。因此，宽场显微镜是一种有吸引力的方法。
然而，光学厚且异质的样本——如致密细胞培养、类器官和活体生物——在宽场成像中产生大量离焦荧光，降低对比度和定量准确性。虽然光学切片技术可缓解这些影响，但可能带来速度、光毒性或实验复杂性的权衡。因此，只要能有效抑制背景荧光，宽场显微镜仍然非常有价值。
> 灵敏度取决于最大化样品信号强度和相机信号收集，同时最小化样品背景和相机读出噪声等噪声。虽然可通过更强照明或更长曝光时间提高信号水平，但这些方法可能导致光漂白和光毒性，损害样品活力并限制成像速度。低信号样品的相关挑战可通过 THUNDER 计算清除与 Kinetix22 高量子效率（QE）和低读出噪声的结合克服。
> 空间分辨率由显微镜光学和相机像素尺寸共同决定。光学方面通过 THUNDER Imager Cell 与广泛 Leica 显微镜物镜的兼容性以及 Smart Correction Collar（SmartCORR）技术解决，该技术提供物镜校正环设置的无手优化以匹配实验，通过减少球差改善图像质量。相机像素尺寸由 Kinetix22 的 6.5 µm 像素解决，这是兼顾高倍和低倍物镜使用的平衡像素尺寸，即使在低倍下跨大样本也能实现亚细胞分辨率。
> 成像速度主要由相机决定，主要受曝光时间和与 PC 的数字接口影响。Kinetix22 相机在 Speed 模式下可超过 660 帧每秒（fps），在针对灵敏度和动态范围优化的模式下超过 110 fps。结合其高灵敏度和最新 PCIe（Peripheral Component Interconnect Express）线缆，Kinetix22 即使在短曝光时间也能采集高对比度图像，支持真正高速成像。
> 视场（FOV）取决于相机和显微镜系统的综合性能。Kinetix22 和 THUNDER Imager Cell 具有匹配的 22 mm FOV，相比光学视场不匹配的配置，每帧可捕获更多数据。Kinetix22 是少数能充分利用 THUNDER Imager Cell FOV 的相机之一。
THUNDER Imager Cell 与 Teledyne Photometrics 的 Kinetix22 相机提供高速、高性能成像平台。系统的高灵敏度支持弱光成像，有助于最小化光毒性并保留生理学相关数据。Kinetix22 的 22 mm 视场、95% 量子效率和亚电子读出噪声实现跨大样本的高效光子收集。
虽然灵敏度、分辨率、速度和 FOV 的仔细优化至关重要，但这些参数本身无法完全克服厚散射样本宽场成像的基本光学限制。关键剩余挑战是离焦光造成的背景雾。在类器官或组织等厚散射样本中，该背景噪声降低对比度、信噪比（SNR）和定量准确性，在需要低光剂量的活细胞实验中尤其成问题。
Leica Microsystems THUNDER 技术在此发挥重要作用，实时增强图像对比度，同时仍使用户受益于宽场系统典型的速度和温和照明条件。
THUNDER 的核心是 Computational Clearing（CC），Leica Microsystems 专利的背景扣除方法，实时分离聚焦信号与离焦模糊。与重新分配图像中所有光（包括散射光）的传统反卷积方法不同，Computational Clearing 有效区分信号与背景。通过排除不需要的背景，该方法提供更真实的 3D 结构表示并生成高分辨率、高对比度图像。
THUNDER 计算清除可在采集过程中实时应用，或后处理应用。THUNDER 提供三种清除模式：
> Instant Computational Clearing（ICC）：为活或动态样本实现单幅图像去雾。
> Small Volume Computational Clearing（SVCC）：为薄样品添加定制 3D 反卷积。
> Large Volume Computational Clearing（LVCC）：为类器官和组织切片等厚样品添加优化 3D 反卷积，以改善大体积深处的对比度。
THUNDER 保留定量荧光强度关系，在曝光时间和信号强度水平保持线性响应。在异质背景荧光水平的样品中提供一致性能。通过比传统宽场方法更清晰可视化大体积样本深处，THUNDER 揭示否则会被离焦光遮蔽的结构细节，使厚样本可用于稳健分析。
此处展示 THUNDER Imager Cell 配合 Kinetix22 sCMOS 相机在多种大型 2D 和 3D 生物应用中的性能，说明 THUNDER 对不同样品类型的影响。
结果
第一个示例中，THUNDER Imager Cell 配合 Kinetix 22 sCMOS 相机在标准显微镜载玻片上对整个 U2OS 细胞群成像，倍率为 10x（图 1）或 20x（图 2）。关键是即使 10× 低倍也保持了高空间分辨率，如图 1 和图 2 放大插图所示。这在大视场实现亚细胞分辨率，可在保留精细结构细节的同时成像非常大的细胞群。
如先前图 1 和图 2 所示的低倍（10x 和 20x），THUNDER Imager Cell 和 Kinetix22 可在物镜数值孔径（NA）略低时最大化 FOV 并略降空间分辨率。切换到更高倍率如 40x 或 63x 水浸时，借助 Kinetix22 6.5 µm 像素尺寸的 Nyquist 采样可最大化空间分辨率，如图 3 所示。
借助 THUNDER Imager Cell，THUNDER 计算清除技术可进一步提高对比度和特征识别。图 4 演示原始宽场图像与 THUNDER 计算清除图像的对比，两图同位置附有 line profile，展示 THUNDER 清除过程后定量信号值和信背比的变化。
THUNDER 带来的图像质量和分辨率改善使可观察到否则被散射光遮蔽的结构细节。图 5 进一步演示，包含有丝分裂细胞的放大插图。THUNDER 计算清除后，个别着丝粒可更清晰辨别，突显实现的增强对比度和分辨能力。
为进一步演示 THUNDER 对精细结构可视化效果，从不同细胞系（HeLa 细胞）采集图像，使用不同荧光标记。如图 6，该样品显示更小的亚细胞特征，包括各核内详细结构和周围细胞骨架，THUNDER 计算清除后更清晰分辨。
除固定 2D 细胞培养外，THUNDER 计算清除对大型复杂 3D 培养如类器官也有显著益处。为演示，对由中脑神经元和非神经元细胞组成的 1 mm 直径类器官成像，使用 THUNDER Imager Cell 配合 Kinetix22（图 7）。由于其厚度，该样品比先前 2D 样品产生更多离焦光，对 THUNDER 是更具挑战性的样品。
更厚样品固有产生比 2D 细胞样品更多离焦光，THUNDER 计算清除效果更显著，分辨率和对比度大幅改善。THUNDER 还应用于同一神经类器官的 3D 延时数据集。该数据集的代表帧（以相对于成像轴的斜角观察类器官）见图 8。该观察角度进一步突显 THUNDER 对厚 3D 样品的影响，揭示原始宽场图像中无法辨别的结构特征、位置信息和形态。
最后示例中，THUNDER Imager Cell 配合 Kinetix22 对斑马鱼胚胎成像（图 9）。这些大型复杂样品对光高度敏感，需要温和照明和大视场以捕获整个样品并获得良好图像质量。图 9 比较原始宽场图像与 THUNDER 计算清除图像，并附 line profile 显示对信号和背景的定量影响。
讨论
结果表明，THUNDER Imager Cell 系统配合 Kinetix22 相机可在大视场成像同时保持亚细胞分辨率。系统的高灵敏度可使用更低照明水平和更短曝光时间，有助于最小化固定样品光漂白和活细胞实验光毒性。图像质量和对比度通过 THUNDER 计算清除进一步增强。通过去除宽场图像固有的模糊和雾，可更清晰标记信号和背景以实现更准确分析。总之，该方法扩展宽场显微镜对光学挑战性样品的适用性，补充光学切片技术。
THUNDER Imager Cell 与 Kinetix22 结合的主要优势：
> 匹配 FOV：THUNDER Imager Cell 和 Kinetix22 均具有 22 mm 视场，优化图像采集，相比典型 CMOS 相机可从大区域捕获数据。
> 速度与灵敏度：Kinetix22 sCMOS 相机支持动态样品高速采集，其弱光敏感成像（95% QE）和亚电子读出噪声水平允许降低照明强度和曝光时间。
> 倍率下的分辨率：如本研究所示，使用一系列倍率（10×、20×、40× 和 63× 水浸物镜）成像。在所有倍率下，THUNDER Imager Cell 配合 Kinetix22 相机在 2D 和 3D 样品中提供亚细胞分辨率图像和清晰特征识别。
> THUNDER Computational Clearing：可在采集期间或之后随时应用，在广泛挑战性 2D 和 3D 样品中生成高对比度、高分辨率图像。
> 智能自动化：THUNDER Imager Cell 系统集成 Adaptive Immersion 以优化水浸物镜性能、SmartCORR 以校正深度球差，以及 Kinetix22 sCMOS 相机的高级触发。配合简化的实验设置和导航，形成强大、易用的自动化成像平台。
小结
THUNDER Imager Cell 配合 Kinetix22 sCMOS 相机提供稳健、高速平台，用于大型复杂生物样品的低剂量、高对比度 2D 和 3D 成像。这些能力共同提供平衡、活细胞友好的成像解决方案，非常适合发现生物学应用。
References
1. An Introduction to Computational Clearing https://www.leica‑microsystems.com/science‑lab/life‑science/an-introduction‑to‑computational‑clearing/
2. Leica Microsystems ‑ THUNDER Imager Cell ‑ Product Overview: https://www.leica‑microsystems.com/products/thunder‑imaging-systems/p/thunder‑imager‑cell/
3. Teledyne Photometrics Kinetix22 sCMOS Camera ‑ Product overview: https://www.teledynevisionsolutions.com/products/ kinetix/?model=01‑KINETIX‑22MM‑M‑C
4. Kinetix22 CMOS Camera Datasheet (rev. 2024): https://flir.netx.net/file/asset/60499/original/attachment
Materials and Methods
> U2OS 细胞用 MitoTracker™ Red CMXRos（ThermoFisher Scientific, M7512；250 nM）在 37 °C 标记 30 分钟，然后在 3% FA 中固定。细胞进行免疫荧光（IF）处理，使用抗微管一级抗体（DM1A）和 Alexa Fluor™ 647 偶联抗小鼠二级抗体。细胞核用 DAPI（1 µg/mL）染色，F‑actin 用 Alexa Fluor 488 Phalloidin（165 nM，10 分钟）标记。细胞在 PBS 中洗涤并用 Mowiol DABCO 封片。
> 固定 HeLa 细胞用 GFP 标记细胞核并用 MitoTracker Red CMXRos 染色线粒体。
> 人源中脑神经类器官（约 1 mm 直径）用 DAPI 染色细胞核，β‑tubulin 作为神经元标记，GFAP 作为星形胶质细胞标记。β‑tubulin 和 GFAP 使用 Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594 偶联抗体检测。
> 活斑马鱼幼体用 GFP 标记黑色素细胞标记。
> 显微镜：Leica Microsystems THUNDER Imager Cell 系统（基于 DMi8 的平台），配备 SmartCORR 和 Adaptive Immersion 技术。
> 物镜：10x 物镜（Ob. HC PL FLUOTAR 10x/0.32）、20x 物镜（HC PL APO 20x/0.80）、40x 物镜（HC PL APO 40x/0.95 CORR）、63x 物镜（水浸 63x/1.2）
> 相机：Teledyne Photometrics Kinetix22（22 mm 对角传感器；2400 × 2400 像素；6.5 µm 像素尺寸；95% QE；约 0.7 e‑ 读出噪声；全帧最高 500 fps）。
> 照明：CoolLED pE‑800 LED 光源，8 通道和液体光导。
> 软件：LAS X Life Science 版本 3.10
> Z 堆栈：0.6‑1.0 µm 步进；总深度 80–200 µm。
> 曝光：每通道 10‑50 ms。
> 照明强度：10% 或更低。
> 剂量最小化：短曝光和低照明的结合，均利用 Kinetix22 相机的高灵敏度。
> 图像在宽场配置下采集。
THUNDER 计算清除图像在采集期间或之后生成。处理的 3D 数据集使用精确深度学习细胞分割工具分析，提取形态学和定量参数如细胞核计数、类器官体积和腔面积（数据未显示）。
Acknowledgements
我们感谢以下个人对本应用说明的支持：
> 细胞系（U2OS 和 HeLa 细胞）：Niloufer Irani 博士，牛津大学 Micron Bioimaging Facility。
> 脑类器官：Tanya Singh 博士，牛津大学生理学、解剖学与遗传学系。
> 斑马鱼胚胎：Richard White 小组（Francisco López‑Cuevas 和 Vicky Tan），牛津 Ludwig 癌症研究所，牛津大学 Nuffield 医学系。
> 数据采集和研讨会支持：Deepthi Konthalapally 和 Abdullah Ahmed，Leica Microsystems。
> 成像设施和支持：Niloufer Irani、Deirdre Kavanagh 和 Lothar Schermelleh，牛津大学 Micron Bioimaging Facility。
> 稿件审阅：Sarah Piper 博士、Jen Lee 博士和 Abdullah Ahmed。
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