全动物活体成像优化

动物研究对我们理解人类疾病贡献重大，是开发治疗药物及其他治疗剂既定且必不可少的步骤。这些研究在临床前阶段进行，先于人体临床试验中的药物筛选。

动物研究对我们理解人类疾病贡献重大，是开发治疗药物及其他治疗剂既定且必不可少的步骤。这些研究在临床前阶段进行，先于人体临床试验中的药物筛选。这些研究旨在确定疗效、安全性、剂量和毒性，以及风险-收益权衡。生命科学和化学分析中有许多既定、标准化的动物研究方法。

生命科学实验大致分为三类：体外（in vitro）、离体（ex vivo）和体内（in vivo）。体外测试在活体生物外研究生物物质（细胞或组织），实验通常在培养皿中进行。体外研究的好处是提供细胞和分子分析，以及为未来研究建立细胞系。

然而其最大局限是无法复制生物体的自然发生环境。为此，体外技术持续发展，如类器官和器官芯片，在补充并在某些情况下取代细胞培养和动物模型测试方面展现前景。

相比之下，离体用于研究从其他机体刺激中移除的特定器官和组织功能，在受控条件下进行。该过程通过在生物体外人工模拟机体功能同时研究感兴趣的提取器官/组织，如图 1A 所示。

若有证据表明实验策略在体外/离体实验中有效，研究可进展到体内实验以收集更多信息和验证。体内实验采用完整活体生物，而非离体组织或体外受控细胞实验。

动物试验和临床试验是体内研究的两种形式。体内测试常与体外结合，以观察实验过程对整个生物体的影响。小鼠、兔、豚鼠和猴子（非人灵长类）是临床前体内实验中评估潜在治疗的常见动物，如图 1B 所示。因此，体内成像对关键生命科学研究确定前进路径至关重要。

非侵入性体内成像技术的进步使动物模型在越来越多的临床前药物研发项目中得到有效使用。这些进步也使研究人员能够进行长期纵向实验，加深对动物模型的理解并缩短达到定量评估的时间。这进一步减少了完成体内研究所需的动物标本数量。

有几种成像模态已广泛用于小动物体内成像：光学成像（OI）、磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）、显微计算机断层扫描（µCT）、单光子发射断层扫描（SPECT）、扫描电子显微镜（SEM）、超声（US）和正电子发射断层扫描（PET）。

在很大程度上，这些不同模态是互补而非竞争的。为促进互补方法，一些供应商在同一仪器中实现多种模态，其他则提供不同成像模态间样品转移的便利。例如，OI 和 µCT 成像的组合已在多种商用体内成像系统中实现。

光学成像（OI）二十多年前随体内成像引入而首次用于临床前。OI 的优势在于非侵入性，可对动物活体成像，使该技术能够提供快速、纵向、准确、实时和定量的药物疗效评估。

典型小动物体内成像系统由"暗箱"组成，暗箱内封装相机、光学器件和动物受试者。暗箱内成像动物数量从单个到多达十个不等。暗箱内还有配件集合，如麻醉歧管和动物托盘，构成实验设置。除设备外还有系统电子学和通常的相机冷却器，与主"暗箱"分离 [1]。

OI 是利用各组织光学散射特性差异形成图像的技术。不同 OI 成像技术提供有关动物结构、代谢和生理的互补信息。各技术提供的信息可通过图像配准机制协同，合并各技术获得的图像。

生物发光成像（BLI）和荧光成像（FLI）是 OI 中使用的主要成像技术。BLI 是酶促反应的结果，FLI 发生在一波长入射光被荧光探针吸收后以不同（通常更长）波长发射时。这意味着 FLI 需要光源激发荧光分子（荧光团），荧光团发射光子形成图像 [2]。相比之下，BLI 使用昆虫、细菌和植物中天然存在的发光蛋白（荧光素酶）进行体内细胞标记 [3]。

虽不能直接转化到临床，这些技术因易用、灵活、廉价和快速图像采集能力已成为研究环境中小动物成像的主要资源。这些技术也有利，因为临床前研究前在组织培养中开发的某些模型和测定可直接转移到小动物。全动物分子 OI 的主要动物模型是小鼠，"鼠类"研究为标准。大鼠成像也可行，较大动物（如兔或非人灵长类）可通过浅表成像研究。

光学成像作为模态因更灵敏相机、更大处理能力和数据存储容量以及更复杂算法而进步。与其他成像模态的相关性变得更简单，某些情况下通过共用设备或仪器间穿梭实现基准标记配准而无缝。这允许从同一动物同时或随时间收集互补数据 [1]。

体内应用，尤其使用荧光团的，必须考虑激发光源特性以防止不必要的组织损伤。例如，深蓝或紫外（UV）可导致组织创伤，而红外（IR）激发可导致组织加热。

另一问题是某些波长穿透组织差，可见蓝/绿波长穿透深度低，限制其用于很小动物或表面成像 [4]。与此考虑并列，动物内成分如血红蛋白及相关分子在可见蓝/绿范围天然荧光，即组织自发荧光。因此，大多数常规荧光团的最佳激发波长在深红或近红外范围，通常称为 NIR-I 窗口，因具有足够组织穿透和低组织自发荧光。图 2 以下根据光学吸收和散射特性差异显示光谱表征的血液和组织。

不同波长因各组织类型的散射系数不同而以不同方式散射和穿透组织。生物组织内散射程度 μs′(λ) 由函数描述：

μs′(λ)=αλ⁻ω

其中 α 与组织中散射中心浓度及周围介质与散射体折射率之比相关。ω 为波指数，与组织散射系数行为相关，生物组织中值通常介于 0.2 ~ 4，λ 与入射光波长相关 [5,6]。

因此，使用的波长越长，散射越少，组织穿透越深。NIR-I 窗口（760-900 nm）内的波长有利，因其被组织中的水和血红蛋白吸收差，与可见范围不同。这使组织变得透明（因其主要由水和血红蛋白组成），允许 NIR-I 荧光团在组织深处被检测。然而，这些激发波长也引起生物组织自发荧光，污染数据采集 [7]。NIR-II 波长范围内的体内成像具有进一步优势。NIR-II 波长窗口涵盖更长波长（1000-1700 nm），生物组织内散射更少。

尽管各种生物组织吸收增加，减少散射连同组织自发荧光减少有助于比 NIR-I 成像获得更高空间分辨率。两个波长窗口根据所需波长范围和分辨率需要 HiRho CCD 传感器或 InGaAs 传感器。图 3 显示多种成像模态及体内可达到的成像参数。

有效图像采集由若干成像参数驱动，主要是探测器灵敏度、空间和时间分辨率以及累积噪声。大多数高性能体内成像系统使用电荷耦合器件（CCD）或 InGaAs 二维阵列探测器，取决于发射信号的波长。这些参数的具体内容见表 1。通常体内荧光团产生微弱信号，因需要较长曝光，需要低噪声探测器。因此，大多数体内成像系统采用深度冷却相机 [8]。

表 1：InGaAs 焦平面阵列传感器和硅 CCD 传感器的特征参数。

灵敏度可定义为系统的"光子捕获"能力。量子效率（QE）是系统将光子转换为电子产生数字图像的定量能力的函数。系统 QE 常简化为仅描述相机探测器 QE，但探测器 QE 结合光学和滤光片透射率将决定系统收集的信号百分比。

灵敏度还受发射光子波长影响，每种探测器具有对应特定波长范围的最佳 QE。CCD 探测器在 350 至 1000 纳米（nm）之间敏感，但标准硅 CCD 探测器 QE 从 800 nm 急剧下降。典型 CCD 探测器在中可见范围具有峰值 QE。

因此，大多数体内系统需要背减薄或背照（BSI）CCD。该制造方法增加光子吸收，产生比前照 CCD 高得多的 QE。InGaAs 探测器通常覆盖 900 - 1700 nm 波长范围，部分可达 2.5 微米。该范围称为短波红外或 SWIR，涵盖 NIR-II 窗口。短波红外（SWIR）范围内的荧光成像在生物医学界引起广泛关注，如上所述。

图 4 显示 CCD 和 InGaAs 探测器的典型 QE。由高阻体块硅（HiRho）制造的探测器在近红外具有更高 QE，并在图像中产生更少条纹图案。条纹由单色光在 CCD 传感器内反射的相长干涉引起。这些探测器提供 900-1050 nm 成像能力，在 CCD 和 InGaAs 原本性能受限的范围。该灵敏度对应 NIR-I 窗口。InGaAs 探测器在 1000 nm 至 1600 nm 范围具有非常一致的 QE。

空间分辨率是传感器能分辨的最小物体。样品结构和发射强度决定准确数据采集所需的空间分辨率，传感器尺寸也是因素。传感器尺寸和光学器件重要，因其确定视场和从样品收集的总信号。这些参数受相机和光学器件性能、经济性和当前可用性影响。像素计数也是因素，通常决定特征分辨率。较小像素允许更高分辨率，但以较低动态范围为代价，因为在给定噪声水平下收集的信号少于较大像素。应对该限制的一种方法是像素合并，将多个像素的信号累积添加到单个像素，提高灵敏度但降低分辨率。

探测器可有广泛分辨率范围。以 CCD 探测器为例，空间分辨率可为 320 x 240 至 1600 万像素。光学体内系统中，典型 CCD 格式分辨率从 512 x 512 至 2048 x 2048。这通过通常 10 - 15 µm 的像素尺寸实现。这些像素累积形成约 30 x 30 mm 的大像素阵列尺寸。体内 OI 应用中最常用的三种探测器由 Teledyne e2v 制造，见表 2。这些探测器具有典型体内探测器特性，包括空间分辨率、低噪声和高灵敏度。

表 2：CCD47-10、CCD42-40 和 CCD230-42 传感器最常用于体内成像。像素间距、满阱容量和峰值 QE 等特性可在三种类型间比较。

弱光成像和光谱应用（如体内成像）依赖高灵敏度硅或 InGaAs 科学探测器。为确保高灵敏度，必须冷却相机以最小化热致噪声。通过冷却系统，通常至 -60 °C 和 -100 °C 之间，并降低噪声，积分时间可从数分钟到数小时。例如，暗电流是相机在无光情况下产生的热噪声。使用真空密封确保系统冷却，该背景噪声显著降低。

另一例是读出噪声，由相机电子学如输出放大器产生。该噪声是弱光图像的限制因素。通过冷却 CCD，传输速率变慢同时提高电荷转移效率，整体降低读出噪声。在 InGaAs 相机中，暗电流可与读出噪声一样显著，常为弱光应用的限制因素。除暗电流外，InGaAs 相机还受环境背景辐射影响。因此，InGaAs 相机必须冷却传感器及光路以减少这些噪声贡献。

虽然多年来科学相机使用多种冷却技术（如热电、低温、焦耳-汤姆逊），热电（TEC）即 Peltier 冷却因免维护和可靠运行而最具吸引力。使用 TEC 实现最深冷却需要多种参数，如传感器周围超高真空（UHV）环境、无出气材料、无环氧树脂以及永久全金属气密密封。为最大化光通量，单窗真空设计最佳。该设计确保真空窗是入射光子在到达探测面前遇到的唯一光学表面。

然而，真空窗每个未镀膜光学表面可有高达 4% 透射损失。在弱光应用中，该损失可导致信噪比显著降低。此外，系统内任何反射光可导致眩光和条纹，尤其与相干照明一起使用时。为解决此限制，对光路中的窗口应用抗反射（AR）镀膜。

这使透射损失降至 <1%，某些镀膜可达 <0.5%。为优化设计，应纳入高效热交换器。热交换器允许高热耗散，配合智能控制实现高可靠性和温度稳定性。下图显示典型高性能真空组件，以及 CCD 冷却对暗电流噪声的积极影响。

体内成像是治疗剂开发的重要组成部分，为确定人体临床试验成功率提供关键临床前数据。全动物成像在很大程度上依赖引入系统的荧光团以测量潜在制剂的有效性，以及疗效、安全性、剂量和毒性。

体内成像的局限与空间分辨率、波长穿透深度和生物组织自发荧光相关。NIR-I 和 NIR-II 窗口内的荧光团已开发以减少这些局限。NIR-I/-II 荧光团通过减少组织散射、减少组织吸收和减少组织自发荧光提高空间分辨率。

可见范围荧光团仍常用于体内成像，因该范围内有多种经医学批准、低毒性、可用于临床的荧光团。对于可见范围荧光团，CCD 传感器常用于光学成像，NIR-I/-II 荧光团需要 HiRho CCD 或 InGaAs 传感器。这些传感器在 750 - 1050 nm 和 1000 - 1600 nm 分别具有高 QE，因此最适合 NIR-I/-II 成像。为确保最低噪声，这些传感器需深度冷却，尤其在体内实验典型的弱光成像中。

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