活体细胞超多重 CARS 成像

流行的分子成像技术只能揭示人体内已用色素或荧光蛋白标记的特定分子的分布或行为。然而，拉曼光谱学允许研究人员通过光谱分析识别未标记分子的组分。

流行的分子成像技术只能揭示人体内已用色素或荧光蛋白标记的特定分子的分布或行为。然而，拉曼光谱学允许研究人员通过光谱分析识别未标记分子的组分。振动（拉曼）光谱因此通常被称为分子指纹。使用这种无标记分子成像增加了发现体内意外变化和异常的可能性。1

一种创新的基于拉曼的技术，称为超多重 CARS 光谱成像，在实验和临床应用的微型化、无创、实时和细胞水平分子诊断方面展现出巨大效用。该技术能够通过对宽光谱范围内同时采集的定量光子数据进行观察和分析来观察和分析生物结构和过程，并持续得到改进和完善。

例如，日本筑波大学的 Hideaki Kano 副教授及其同事最近对活细胞进行了超多重 CARS 光谱成像（18 种颜色对应 18 个波数），每像素有效曝光时间为 1.8 毫秒，这是迄今为止报道的宽带 CARS（光谱覆盖范围约 3000 cm⁻¹）的最快速度。2

相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）得名于这种非线性光谱技术并非使用传统单激光器，而是利用一对非常强的相干激光束照射样品，从而产生反斯托克斯频率信号。第一束激光的频率通常恒定，第二束激光的频率可调，使两束激光的频率差等于感兴趣的拉曼活性模式的频率。该特定模式将是拉曼信号中唯一极强的峰。3

CARS 比正常拉曼发射强几个数量级。执行 CARS 不一定需要单色仪；宽带干涉滤光片配合滤光片后的探测器可能即可。下文给出 CARS 的数学和示意图描述。见图 1a。

频率为 ω₁ 和 ω₂（ω₁ > ω₂）的两束激光相干相互作用，产生频率为 2ω₁ - ω₂ 的强散射光。若两束激光的频率差（ω₁ - ω₂）等于拉曼活性振动、转动或其他模式的频率 ωₘ，则产生频率为 ω₁ 的强光。

换言之，要获得强拉曼信号，应调节第二束激光的频率使 ω₂ = ω₁ - ωₘ。此时强散射光的频率为 2ω₁ - ω₂ = 2ω₁ - (ω₁ - ωₘ) = ω₁ + ωₘ，高于激发频率 ω₁。

除克服大多数生物分子信号强度低的问题外，CARS 还提供定向发射和窄光谱带宽，且无自发荧光干扰。CARS 研究涵盖微生物细胞、真核细胞、捕获细胞、医学组织、上皮组织、肌肉组织、神经组织、肺组织、乳腺组织、骨骼和皮肤。4

CARS 显微镜的快速扫描能力对研究实时动态的研究人员极为宝贵。此外，与荧光显微镜技术不同，CARS 中细胞可反复成像而无光漂白导致的褪色问题。5

多重 CARS（见图 1b）是一种增强的 CARS 技术，采用与光谱仪耦合的多通道探测器（例如科学 CCD 或 CMOS 相机）以覆盖相干拉曼信号的宽光谱范围。

通过使用宽带激光源（例如超连续谱光源或飞秒激光源）代替可调激光 ω₂，多重 CARS 信号的典型光谱覆盖范围可进一步扩展，达到约 3000 cm⁻¹。这种超多重 CARS 光谱成像方法足够宽，可检测所有振动基频模式——包括至关重要的指纹区（可识别并区分未知有机化合物）以及 C-H 和 O-H 伸缩区（有助于识别脂质、蛋白质和核酸的粗略分子分布）。2

2000 年春天，Hideaki Kano 博士作为博士生参加旧金山 CLEO 会议时，被利用光子晶体光纤产生超连续谱所吸引——只需飞秒激光振荡器即可产生超连续谱（SC）。后来，在东京大学 Hamaguchi 实验室开始学术生涯后，他开发了利用 SC 产生的自制逆拉曼（现常称为受激拉曼损失，或 SRL）光谱系统。6

实验中，Kano 博士偶然发现了 CARS 信号，其强度非常高，实际上比逆拉曼（即 SRL）信号容易检测得多。他很快意识到将 SC 产生与光谱装置相结合将是基础光谱学领域的突破，也将惠及刚刚兴起的生命科学光谱成像。

Kano 博士的实验装置纳入了两台激光源，以及一款具有高读出速度和高 NIR 灵敏度的新型 CCD 相机和高通量光谱仪。见图 2。

第一台激光源基于主振荡器光纤放大器（MOFA）配置，涉及微芯片振荡器——由 Nd:YVO₄ 晶体与可饱和吸收镜键合的被动 Q 开关激光器——以及 Yb 掺杂光纤放大器。第二台源为被动 Q 开关微芯片 Nd:YAG 激光器。研究人员可根据所研究样品类型切换激光源，在波长、脉冲持续时间、重复频率和输出平均功率方面提供良好的实验灵活性。2

一款新上市科学 CCD 相机提供的 NIR 灵敏度显著高于 Kano 博士及其同事在先前活细胞超多重 CARS 光谱成像研究中使用的最先进 CCD 相机。7

除在重要 NIR 体内成像波长处具有更高灵敏度外，新相机还提供与 Kano 博士时间分辨研究中使用的超快激光同步所需的高速运行。研究人员将相机耦合到高通量光谱仪，后者将透镜收集的 CARS 信号色散以供相机检测。

在用于活细胞成像之前，实验系统首先通过测量聚苯乙烯微珠（直径：10 µm）的 CARS 信号进行评估。微珠的超多重 CARS 信号在 600 cm⁻¹ 至 3600 cm⁻¹ 范围内被检测到，分辨率 <10 cm⁻¹。像素驻留时间约 1 毫秒，以约 28 秒的总数据采集时间采集了 161 × 161 像素的 CARS 图像（图 3）。2

系统首先以聚苯乙烯微珠评估性能：161 × 161 像素 CARS 图像在约 28 s 内采集完成，光谱覆盖 600–3600 cm⁻¹（图 3）。

验证聚苯乙烯微珠成像系统性能后，研究人员使用高速、高灵敏度 CCD 相机和 MOFA 激光源对活细胞（A549）进行成像（图 4）。红色光谱中 2850 cm⁻¹ 处的尖锐峰对应细胞内的一个亮点，进而对应主要在细胞内脂滴中观察到的 CH₂ 伸缩振动模式。注意原始 CARS 信号由振动共振信号和非共振背景组成，两者相互干涉产生色散线型。2

Kano 博士及其同事随后通过数值分析提取纯振动共振信号，以获得与自发拉曼等效的光谱轮廓。他们发现这些结果光谱轮廓的主要特征与细胞内脂质和蛋白质的特征吻合良好。3427 cm⁻¹ 至 1009 cm⁻¹ 之间的十余条特征拉曼带对应于振动模式。2

有关更多数据和本研究的更详细讨论，请参阅以下文章：Hideaki Kano, Takumi Maruyama, Junko Kano, Yuki Oka, Daiki Kaneta, Tiffany Guerenne, Philippe Leproux, Vincent Couderc, and Masayuki Noguchi, "Ultramultiplex CARS spectroscopic imaging with 1-millisecond pixel dwell time," OSA Continuum 2, 1693-1705 (2019).

研究人员对活细胞进行了超多重（600 cm⁻¹ - 3600 cm⁻¹）CARS 光谱成像，报告了迄今为止宽带 CARS（光谱范围约 3000 cm⁻¹）的最快速度。基于清晰的分子指纹，Kano 博士及其同事用 15 条以上振动带可视化了细胞内分子分布。软件中 1 毫秒的曝光时间相当于每像素约 1.8 毫秒的有效曝光时间，与 Kano 博士先前活细胞成像研究（每像素曝光时间 50 毫秒）相比显著缩短。改进主要归因于新上市 CCD 相机更高的灵敏度和读出速度。2,7

这种高速技术与多变量分析方法相结合，可帮助生命科学家和医生深入了解细胞内代谢活动的动态。Kano 博士的研究组目前正与病理学家合作，利用分子指纹开发新的光谱诊断工具。

为促进其最新工作，研究人员选择了一台 Teledyne Princeton Instruments BLAZE® 相机，配备由高阻体块硅制造的专有"超深耗尽"CCD。8 该相机设计为提供任何硅器件中最高的近红外量子效率，采用背照 1340 x 400 光谱阵列格式（20 µm 方形像素），可在空气中冷却至 -95°C，无需冷水机或液体辅助，实现低暗电流性能。

BLAZE 还为研究人员提供 CCD 相机中最快的 ADC 速度。新传感器平台的双 16 MHz 读出端口经工程设计，可在全垂直 binning 下实现超过 1600 光谱/秒的空前光谱速率，在动力学模式下运行时可高达 215 kHz。

与 BLAZE 相机配合使用的光谱仪为 Teledyne Princeton Instruments LS-785。由于其具有专有 AR 镀膜透镜的快速 f/2 光学系统可实现最佳 NIR 透射，LS-785 的通量可达标准 f/4 反射式光谱仪的 4 倍。CCD 相机和透镜式光谱仪的所有功能和时序均通过 Teledyne Princeton Instruments LightField® 64 位软件在实验装置内控制和协调。

Teledyne Princeton Instruments 感谢 Hideaki Kano 博士（日本筑波大学）对本应用说明的宝贵贡献。

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